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本试验采用犬细小病毒单克隆抗体(CPV McAb)配合静脉注射用犬免疫球蛋白及静 2 f B/ `7 p- T ?0 U7 g
" ?. T- H6 P( G: W9 H脉注射用犬血白蛋白对343例患细小病毒病的犬,经股内侧肌肉注射进行治疗,取得令
3 a) z! [2 ^# `9 [9 w/ k4 V& [
w1 w, @. F! y9 n3 D人满意的结果。1.在收治的343例病犬中,治愈279例,治愈率高达81.34%,显著高于
; p7 z7 a' P1 \- q* n- ]6 d
# Y/ Z) z8 t( I6 O% Y5 S其他治疗方法的治疗效果。2.在收治的343例病犬中,6月龄以下幼犬占90.67%,说明 ' r" Y4 e( r& b P- \5 O# X
6 X7 t9 o ]( i( L7 O, v$ d本病主要发生于6月龄以下。冬季发病较多,其次为深秋或初春,夏季发病较少。3.在
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2 ~: o" l1 y! E2 W l临床治疗中发现,发病一天的病犬注射CPVMcAb、静脉注射用犬免疫球蛋白和静脉注射
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2 H) U" a7 c0 i; I p* V5 B8 `用犬血白蛋白,而不采取其他措施,89.47%病犬即可二天内完全康复,发病2天的病犬
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@ _( E: B+ a! q116只,结合对症疗法用这些药物治疗时,治愈90只,死亡44只,治愈率为77.59%。 * p# ?* w+ A& @
% D7 X6 n+ P9 G2 Y. o! R% U发病3天的病犬,治愈率仅为54.84%,而发病4~5天的病犬,治愈率又升高为76%。另 " P7 B0 l9 p# \$ h( B8 Z, b
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外,94.62%的治愈犬用药后4天内完全康复,说明采用该治疗方法治疗还可缩短病程。 ( O3 _4 S* _9 R3 [( v/ R
' t- E% \% c3 V" w- H4.用该药物治疗后当天死亡的病犬,主要是由于发病后期,全身性衰竭、肠道广泛性出
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% ~' q! d$ x" i8 v血、坏死和严重脱水,注射的CPV McAb未能起作用。3天后死亡的病犬,可能是由于 : e4 v! m$ H! H# T
9 j* _- @/ c# B( TCPV McAb虽然中和了体内病毒,但实质脏器的病变未能修复所致。5.通过与以前以抗病 ) G+ I) o3 Q: J- h7 s
9 Z+ Y# J# r9 t$ B S3 @' x毒药(利巴韦林)为主要药物、以抗犬细小病毒血清为主要药物以及单纯使用单克隆抗 % n* O$ W% O" W# R
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体为主的治疗方法的比较发现,用犬细小病毒病单克隆抗体,配合使用静脉注射用犬免
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) n9 L$ q9 J2 d, A3 I) g疫球蛋白及静脉注射用犬血白蛋白的综合性治疗明显地提高了治愈率。6.经邻近腹股沟
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淋巴结的股内侧肌肉注射,进入体内的McAb能迅速到达淋巴组织,中和淋巴组织及血 7 b" Y" M" T% H! y( P4 b* L+ o
. p9 J* u4 o3 d0 W6 W3 B循环中的病毒,阻止其进一步复制和扩散:同时,被中和的CPV和McAb形成抗原抗体 j3 b/ i4 d; [& B! X! e: r
+ _% X) h6 N" `) W6 r+ Q复合物,可促进机体的主动免疫反应,从而达到治愈病犬的目的。7.虽然McAb已开始
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$ d* u; h: D" \3 S" L用于对某些肿瘤、自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗,但抗病毒McAb治疗中的
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应用仍停留在实验研究阶段。
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关键词:犬细小病毒单克隆抗体犬免疫球蛋白 犬血白蛋白
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前言
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犬细小病毒病是由犬细小病毒(CpV)引起的一种急性传染病,临床上多以出血性 ! W+ ?" V% @" s- u: ]+ I
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肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征。有时其感染率可达100%,致死率可达10%~50%, " Y" l5 @3 V! N4 J
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解放军军需大学于1982年在长春地区首次分离出该病原——犬细小病毒,证实了我国 8 ~& i* |. F4 f* n4 \7 ]3 x
! k3 W: q; R# f. G( T$ C3 J4 l2 z有本病的存在。病犬是本病的传染源,病犬的粪、尿、呕吐物和唾液中含病毒量最高。 ( z4 o: Y3 n7 U% c- G
" P" A9 `+ }4 P本病主要通过直接或间接接触传染。虽然犬细小病毒的发现时间不长,但由于该病的危
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4 [( W1 B: g- B' X% a害性极大,各国的动物医学家对该病的病原、流行病学、症状、病理变化、免疫、诊断、 : @( m6 h6 l4 t0 @9 q% u
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治疗等方面都进行了深入的研究,特别是在快速诊断和治疗上有了较为明显的共识,即 ; N0 X z/ T7 j% k
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以特异性治疗为主的综合治疗。随着宠物业的发展和科技的不断进步,对该病的诊断方 ! _4 G0 A8 B5 |% ~8 x" x
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法和治疗手段都有了长足的进步,治疗效果也越来越好。早期治疗犬细小毒病的方法主 7 r/ h2 k l: S# O
- \' V/ Y, Q9 Y: _& O/ Z' W1 S要是以抗病毒药为主的综合治疗,随后又经历了以抗病毒血清为主要药物的治疗阶段和
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( v/ ^1 v( Y0 L; P# i J现在以犬细小病毒单克隆抗体(McAb)为主要药物的治疗阶段,疗效逐步提高。一段时
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% n& H# b& K) @7 z! I" n间以来,上海农林职业技术学院附属动物医院在临床上用犬细小病毒单克隆抗体配合以
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静脉注射用犬免疫球蛋白和静脉注射用犬血白蛋白,同时视病犬情况配合其他疗法,同
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以前治疗方法相比,明显提高了治愈率,使我院附属动物医院在该病的治疗上进入了一
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" g' b/ c$ h' @2 y个新的阶段。本研究将单克隆抗体配合犬免疫球蛋白及犬血白蛋白应用于犬细小病毒病
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+ X7 c6 @/ x4 k8 ~9 r2 @( y9 {9 \5 J这一急性烈性传染病的临床治疗,收治病例全部为自然发病犬,治愈率高达81.34%,对
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0 _2 g' t7 N. |- b5 D2 a2 h应用犬细小病毒单克隆抗体配合犬免疫球蛋白及犬血白蛋白这一治疗方法作了进一步 9 H; J+ Y7 {3 Z4 w: |: V, D H; Y
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的验证,表明该方法疗效确实,同时对其他动物病毒性疾病的l临床治疗也具有一定的参
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3 {$ b! o) Z( D; q1 J( P6 U考价值。
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第一章犬细小病毒与犬细小病毒病 / ^$ j2 ?# k; Q- {
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§1.犬细小病毒 # [3 w- g. b: _3 x5 l+ v" z
7 }7 T2 |$ X3 g1 i§1.1犬细小病毒的起源
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7 ?! v1 b/ l+ i1 K犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)属于细小病毒科细小病毒属猫细小病毒亚
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0 ?! {. b6 w: \' u5 a群[16],本亚群中与CPV密切相关的成员还有猫泛白细胞减少症病毒(Feline ) A4 F2 ?7 i5 Z! _
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panleukopenia virus,FPV)、貂肠炎病毒(Mink enteriti s virus,MEV)和浣熊细小
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- e! \2 K' ]8 n病毒(Raccoon parvovlirus,RPV)等。CPV是1977年由美国学者Eugster和Nairn E271从 ) r- |* @) G0 L1 Q0 b4 Y2 C3 s
$ G; K) o8 R! a- s' R患出血性肠炎的病犬粪便中首先观察到,1978年由澳大利亚的Kelly[38]和加拿大的 ( Y: o- q/ x& d6 j, Z) e6 F+ S( e
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Thomson等首次从患肠炎的病犬中分离到,随后在法国、日本、南非和意大利相继报道 , l5 w; h7 o: x; J
' j- w/ i* s2 {9 D9 U$ e本病。早在1967年,Binn等。[21]从犬分离到第一种犬细小病毒~犬微病毒(minute virus
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of canine,MVC),又名CPV—l。因此,这次分离到的CPV被命名CPV-2,CPV一2在致病 ' ] E1 O( P+ D: R) J* M
7 p. J0 L) ^6 {& F/ }& _. Y2 a性和抗原性上与CPV-1显著不同。CPV一2主要引起犬的出血性肠炎和幼犬的心肌炎,具
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有很高的发病率和死亡率,症状与FPV相似。而CPV一1起初认为是非致病性的,但最近
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% a8 s v" m. S0 P7 o& x的研究表明CPV一1可能引起怀孕母犬的胎儿吸收和流产。 6 i) |4 C8 S. Y; p; T. ^1 C% r
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从1980年起在我国的军犬、警犬、观赏犬和肉用犬等陆续出现该病的疑似病例,
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感染的多半是离乳前后的幼犬,临床表现为剧烈的呕吐、腹泻、排出恶臭的粪便,故又 4 o" }. k/ d3 q9 E; t% Z! C2 ]9 s
& O- m o- k* Z称出血性肠炎,病死率高达50%~80%。我国梁士哲(1982)““等最早报道了类似CPV-2 7 n8 X2 {: |+ L0 |0 `
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所致的犬出血性肠炎,次年徐汉坤[15]等正式报道了本病的流行。 ! s% |+ t' P9 A0 N
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在70年代后期,犬还没有进行过CPV一2的免疫,根据血清学追溯性调查,在1974
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年之前(希腊最早于1974年发现CPV-2阳性血清)没有证据显示有类似于CPV-2的病
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! t5 a% Q% X" l. S; ^; C原存在的报告。在1976年,欧洲犬的血清中有抗体。在世界上许多其他的地区直到1978 ( V7 P' f! p; ]5 c
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年才发现CPV一2的阳性血清。在1978年CPV一2引发的疾病逐渐增多,病原是最初的CPV一2
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: ]1 s! W. f$ ?/ ^( N( e型。随后即发生了抗原漂移,Parrish等[43]指出大约在1979~1981年之间,CPV一2在抗
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原性上和基因型上被变异株CPV-2a自然取代了。在1979年,变异株CPV-2a引发的疾 # S4 C. c# Z9 a" A9 O0 V
# D7 t, \4 |$ i6 O, F病增多了。到1981年,CPV一2a型是美国临床病犬中最常分离到的病原,同样在日本、
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/ q: z3 m9 h+ E2 s' W; l/ a' c* |澳大利亚、丹麦也一样,从1981年以后,CPV一2很少被分离到。大约在1984年,新的
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9 ]8 w. I8 O( u7 q; A变异株CPV一2b在美国被通过单克隆抗体检测到,并逐步流行开来。目前,CPV一2b出现 ) ^ u* A6 e# @5 y$ T& |5 E+ X4 ]
/ x. h T B: B4 y0 h- a的最早记录是日本的1982年CPY—Y株(GenBank:026709)[23]。Parrish[24]等通过对美国
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$ U' r. H0 N" K& ?) k92株分离物检测,表明从1978~1990年各种抗原型变化随着时间不同而不同。CPV一2到 " L7 Z% [% D% u7 ^
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CPV一2a的变化在1979~1981年。CPV一2b抗原型的变化在1984年才发现。到1988年,
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9 q& D, D/ w" G, j* _) |. q% ]: s在美国,CPV一2b是发病犬中最常分离到的抗原型,但是在其他国家,CPV一2a和CPV一2b " C) r$ d3 p5 ^9 }8 P
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( [6 b# r; V8 K4 L出现的机会是均等的。CPV一2a和CPV-2b还具有了感染猫的功能。我国自1982~1996 ! ]+ @% y7 t% B* M/ N, u
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年分离到的均为CPV-2a,从1997年开始分离到了CPV一2b,随着时间的推移,分离到
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CPV-2b的数量成上升趋势。 9 s5 o' g* j# u! f9 _5 f4 e5 B ^
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§1.2.CPV-2的生物学特征 % x& }- |* [% ^0 t. e
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§1.2.1 CPV-2形态和理化性质
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CPV-2粒子为等轴对称的二十面体。病毒无囊膜。核酸由单股DNA组成。在电镜下 . A P9 _3 P' w
; q5 f6 a4 V1 [) c7 M( q显圆形或六角形。直径约22nm。据对部分病毒的分析。DNA约占整个病毒的粒子重要的 1 i: }. n4 \- F0 z
( ^) i- E4 N( C( R# Y' o6 i25~34%。DNA分子量为1.4*10 6次方~1.7*10 6次方。在氯化铯观察密度梯度离心沉淀时。大部分 5 ^! o. U; @1 M+ K' P
- Z4 d% ?) z& z( X" x0 [- B6 ]感染性病毒粒子存在于1.38~1.42/cm3。少部分感染性病毒粒子存在于1.45~1.47/cm立方。
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7 C8 y) D7 y8 Q# W" B) j8 F多数病毒离心中含有3种多肽、VP1(70~90KD),VP2(62~76KD)和vP3(39~69KD)。VP2
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8 v3 g! d) F+ v- g5 f系构成衣壳蛋白成分,是具有血凝活性的物质。 9 p4 ~0 m1 `5 u$ a
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§1.2.2 CPV-2的血凝特性
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+ H" h$ _* r8 o$ J/ Q4 OCPV能凝集恒河猴、猪、马、猫和仓鼠的红细胞。Senda等报道应用硼酸缓冲液和
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病毒调节稀释剂(Virus Adjusting Diluent.VAD)能凝集犬和绵羊的红细胞,但不能 2 N- O# U4 H- v% W# Y+ P! p& [
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凝集牛;山羊;兔;豚鼠:大鼠;小鼠;地鼠;鸡;鹅和人的O型红细胞。FPLV和MEV
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9 N9 q/ I/ V `* g4 s也能强烈凝集恒河猴;猪的红细胞但不能凝集猫的红细胞三种病毒凝集红细胞最适 * a8 A; X8 z# O, q, c
: G; S8 }! i: _) F: p9 XpH5.8~6.O,但CPV在pH7.2时也能很好凝集红细胞。而FPLV,MEV,当pH>6.4时血凝 + G; p( t' b' E# m7 E
$ x. {" l: i8 V# `( C
活性明显下降,此外,pH<6.5时,猪的红细胞又易发生自;疑。据报道,在同样的条件(红 , ?3 p& i6 Y+ P; j- n: p' Y# p
# g: |. D, L* _
细胞;温度;pH值)下,CPV的血凝试验(HA)滴度至少比FPLV和MEV高8倍。
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Senda等报道.在日本1980年以前分离的CPV株为温度依赖型,以4摄氏度时凝集效果 3 H H+ j3 t1 [/ @' |
& ?: r$ g! c( w( p0 c最佳。其抗原性和血凝性与FPLV,MEV基本相似。而1980年后期及1980以后分离到的
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( k3 t' t: O2 H& G: `( F4 d* VCPV株逐渐变成温度不依赖型,不论在4摄氏度,还是37摄氏度,血凝滴度基本不变。而温度 3 z: w& Y: q7 I9 ?7 n4 m7 u$ K, Z
7 m# c9 W, h; C. \3 s2 G
依赖型CPV株及FPLV;MEV在37摄氏度的血凝滴度比4。C时至少低16倍,时间过长会从 5 k1 f' I; D, w* |5 G' A3 `! K l& I
1 ?3 G+ [. Y) G) r红细胞上解脱下来,可用此法提取和浓缩CPV,温度不依赖型侏抗原性与FPLV;MEV有
: }6 l) ?* @; y- K) x) R- M% q% V. m; s! |* L+ i8 m
明显差异(P<O。01)。据此,认为目前CPV有三种,即原始株(温度依赖型株):过渡
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% [7 X4 _" _5 k8 |7 }3 ]4 X, s型株和变异株(温度不依赖型株)。CPV血凝素结构从与FPLV相关变成差异较大,这种
' [3 o( t `6 ?
, V$ z9 @& g/ z0 B# N转变可以从一个侧面说明CPV的起源;发生机理和发展[7,12]。
) h X3 H* T, p+ N9 L$ S
/ E( v& @' U, A+ }& q7 B) {Parrish等报道1978年在比利时从自然发病犬的粪中分离得到的CPV,经NLFK细
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胞反复传代后,病毒的HA活性很快丧失,HA价在第6代为l:1000,到第24代小于l:
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2,但病毒的增殖并不受影响。用82株CPV单抗所做的竞争性血凝抑制试验(HI)试验 2 N5 z; J- @# D8 A3 n
) Z( e6 r: v- Z1 O2 m* ~
和酶联免疫吸附试验(ELISA)试验证实,cPV无HA突变株和野毒株空原性无明显差异。 $ Z @' x$ H: A% p
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用 M13噬菌体mpl8和mpi9分别克隆野毒株及无HA突变株的VPl和VP2衣壳蛋白基因, # q7 ~" J; ^$ q+ W' F- X
, \ C' h; s/ r- D' ^3 R结果发现。两者的VP1和VP2基因的保守区有两个核苷酸序列存在差异,即2243碱基(大 ' V9 V, |' e8 o9 m8 R. t
6 l2 ?$ J5 d7 H% R: }# i* g! ]( P2 ?约77mu)由G突变成A,相应氮基酸由精氨酸突变为赖氨酸;2797碱基(大约88mu) - \9 W1 n1 v0 D' A+ @
; s, F) G3 {) {6 a% U由G突变成c相应氦基酸由缬氨酸突变成亮氨酸,正是这些变化影响了病毒衣壳蛋白的 |
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